۳-با افزایش ویسکوزیته از اثرات سمی دیگر مواد محافظ انجمادی جلوگیری می کنند(Fujiwara et al., 2010)
۱-۸-۳- سمیت ضد یخها
ترکیبات بکار رفته در ضد یخها به سه دسته تقسیم می شوند که شامل: مواد نفوذ کننده ، ساکاریدهای کوچک و ماکروملکولها می باشد.
ماده نفوذ کننده با سمیت کم نیز بسیار مهم است زیرا بیشترین میزان آسیب، ناشی از سمیت این ترکیبها می باشد(Kasai et al., 1992;Tachikawa et al., 1993;Zhu et al., 1993).
از جمله مواد نفوذ کننده مورد استفاده در انجماد شیشه ای می توان به DMSO، گلیسرول، اتیلن گلیکول و پروپیلن گلیکول اشاره کرد. برخی همچون Rall و Fahy (Rall & Fahy, 1985) استامید را به DMSO و پروپیلن گلیکول اضافه نمود ند. اگر غلظت ماده نفوذ کننده در حدود ۲-۱ مول حفظ شود میزان سمیت آن کم می گردد. اما به هر حال در انجماد شیشه ای به منظور جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ غلظت ممکن است به ۸ مول هم برسد و می بایست اثرات سمی این گونه ترکیبات را در نظر داشت(Rall et al., 1987) Kasai (Kasai, 1994) به بررسی میزان سمیت ۵ ماده نفوذ کننده فوق الذکر DMSO، گلیسرول، اتیلن گلیکول، پروپیلن گلیکول و استامید در انجماد شیشه ای مورولای موش پرداخت، که روش کارش به این ترتیب بود که محلولی متشکل از PBI یا PBS و ترکیبات فوق با غلظت (V/V) 30% تهیه کرد و جنینها را به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۰ درجه سانتی گراد در این محلولها قرار می داد و درصد زنده ماندن پس از ذوب و قابلیت تکاملی جنینها در محیط کشت را بررسی می کرد. نتایج این تحقیق نشان داد که در حالی که پروپیلن گلیکول و استامید کاملا سمی بودند، میزان سمیت اتیلن گلیکول از همه کمتر بوده و گلیسرول و DMSO در مرتبه های بعدی قرار داشتند(Kasai, 1994). در انجماد شیشه ای بلاستوسیست گاو، اتیلن گلیکول و گلیسرول از سمیت کمتری برخوردار می باشد (Tachikawa et al., 1993). اگر چه میزان سمیت مواد نفوذ پذیر در گونه های مختلف و یا مراحل تکاملی متفاوت یکسان نمی باشد اما به هر حال نتایج بسیاری از تحقیقات نشان می دهد که اتیلن گلایکول ماده نفوذ پذیر با سمیت بسیار پایین می باشد.(Kasai , 1998)
در برخی از محلولهای انجمادی از ساکارز به عنوان یک پلی ساکارید استفاده می شود(Kasai et al., 1979; Testart et al., 1986) که با افزودن آن از سمیت محلول انجماد شیشه ای به میزان قابل ملاحظه ای کاسته می شود (Kasai et al., 1979; Testart et al., 1986). مونوساکاریدها و دی ساکاریدها به عنوان مواد غیر قابل نفوذ میزان تاثیرات اسمزی را تا مقدار قابل توجهی کم می کند لذا افزودن یک ساکارید کوچک به محلول انجماد شیشه ای باعث افزایش آبگیری سلول و انجماد شیشه ای داخل سلول شده و در ضمن مقدار محلول ضد یخی که وارد سلول می شود را کاهش می دهد و به این ترتیب اثرات سمی آن نیز کمتر می شود. البته تاثیرات ذکر شده برای ساکارز اختصاصی نبوده و تره هالوز، گلوکز ، و گالاکتوز نیز دارای چنین اثراتی می باشند(Kasai, 1996; Kasai, 1997) اگر چه این مواد در درجه حرارت بالا سمی هستند اما در صورت استفاده در درجه حرارت یخچال سمی نمی باشند(Kasai, 1986).
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
افزودن یک ماکروملکول به ترکیب ضد یخ، انجماد شیشه ای را موفق خواهد کرد (Fahy et al., 1984) لذا با غلظت بالا به محلول انجماد شیشه ای افزوده می شود. ماکروملکولها می توانند با کاهش غلظت ماده نفوذپذیر سمیت محلول ضد یخ را کم می کند(Fahy et al., 1984). از میان ماکروملکولهای استفاده شده در تهیه محلولهای انجماد شیشه ای می توان به پلی اتیلن گلیکول (PEG)، فایکول ۷۰ [۶۱] ، آلبومین سرم گاوی (BSA) ، Polyvinyl pyrrolidone و Percoll اشاره کرد
(Kasai, 1996;Kasai,1997). ماکروملکولها به سلول نفوذ کرده و نسبت به مواد نفوذ پذیر سمیت کمتری دارند
(Kasai et al., 1992;Tachikawa et al., 1993;Zhu et al., 1993). Kasai(Kasai, 1994) دریافت که افزودن فایکل ۷۰ به ترکیب اتیلن گلیکول ۴۰ درصد نسبت به PEG برتری دارد.
برای کاهش میزان سمیت در انجماد شیشه ای باید ترکیبی با سمیت کمتر به دست آورد. افزودن بعضی مواد باعث کم شدن غلظت ضد یخ مورد استفاده در سلول می شود. در طی آبگیری سلولها در این محلول، کاستن زمان و کم کردن درجه حرارت می تواند از سمیت بکاهد، هر چند که احتمالا بلورها یخ داخل سلولی بیشتری تشکیل می شود(Kasai, 1998).
۱-۸-۴- انواع روش های انجماد شیشه ای
روش تک مرحله ای : در این روش رویانها از محلول فیزیولوژیکی بطور مستقیم وارد محلول انجماد شیشه ای می شوند(Kasai et al., 1990;Kasai et al., 1992).
روش دو مرحله ای: در این روش ابتدا رویانها در محلول حاوی غلظت پایین ۲۰-۱۰ درصد، ضد یخ نفوذپذیر قرار می گیرند تا نفوذ ضد یخ، تحت شرایط سمیت پایین انجام گیرد و سپس رویانها وارد محلول انجماد شیشه ای می شوند بعد از این مرحله رویانها توسط کانتینرها بارگیری می شوند و بعد در نیتروژن مایع سرد و منجمد می شوند و در آن نگهداری می شوند. درطی فرایند انجماد شیشه ای قرار دادن جنین ها در نیتروژن مایع و سرعت سرمای بالا باعث می شود که جنین ها از یک منطقه دمای بحرانی[۶۲] عبور کنند. این منطقه دمای بحرانی بین°C +15 و -۵°C می باشد که گذر از این منطقه دمایی بحرانی باعث کاهش آسیب های سرمایی می شود.
هم چنین مزیت دیگر کاهش دما، کاهش اثرات سمی مواد محافظ انجمادی و شوک اسمزی می باشد
(Liebrmann et al., 2002; Orief et al., 2005). در طی حفاظت انجمادی علاوه بر نیتروژن مایع، نمونه ها می توانند در بخار نیتروژن نیز ذخیره شوند. میزان سرما برای نمونه های بزرگ که در بخار نیتروژن سرد می شوند ۱۰°C/min و برای نمونه های کوچک ۰°C/min30 < می باشد.
در صورتیکه قرار دادن نمونه ها در نیتروژن مایع باعث ایجاد میزان سرمای ۰°C/min200 تا ۰°C/min2000 می شود (Shaw et al., 2003; Saragusty et al., 2011). علت این تفاوت این است که انتقال گرما از نمونه به محیط در مایع سریعتر از بخار می باشد (Liebrmann et al., 2002).
یکی از خطرات ذخیره جنین های منجمد شده در LN2، وجود احتمال آلودگی در LN2 می باشد. هر چند گزارشات بسیار کمی این مشکل را مطرح می کنند با این حال سه راه حل برای این مشکل وجود دارد:
- استفاده از LN2 فیلتر شده استریل
- ذخیره جنین ها در بخار ازت
- ذخیره جنین ها در سیستم های بسته ای مثل کرایولوپ[۶۳] یا استرا[۶۴]
(Kuwayama et al., 2006; Moor et al., 2006).
مدت زمانی که رویانها در داخل محلول انجماد شیشه ای قرار می گیرند قبل از انجماد بسیار حیاتی است و در طی غوطهور سازی رویانها در محلول انجماد شیشه ای رویانها باید دچار دهیدراسیون شده و تغلیظ شوند ولی این عمل بسیار سریع انجام می گیرد بنابراین این مدت زمان باید به ۳۰ ثانیه کاهش یابد تا از سمیت ضد یخ جلوگیری به عمل آید.
در طی چندین سال گذشته پیشرفت قابل توجهی در جهت حفاظت انجمادی جنین ها و تخمک پستانداران در گونه های مختلف با بهره گرفتن از روش انجماد شیشه ای صورت گرفته است. یکی از مشکلات فرایند انجماد شیشه ای، میزان سرمای نامناسب می باشد به منظور غلبه بر این مشکل چندین روش در نظر گرفته شده است. این روش ها شامل :
۱-۸-۴-۱- روش OPS (Open Pulled Straw)
در این روش از استرا های پلاستیکی استاندارد (۰/۲۵ ml) که قبلا تا نصف قطر و ضخامت دیواره توسط گرما باریک شده اند استفاده می شود. جنین ها با حجم کمی از محلول انجماد شیشه ای (>0/1µl) و بر اساس خاصیت موئینگی داخل و انتهای استراها قرار می گیرند، سپس استراها به داخل نیتروژن مایع منتقل می شوند (Gajda et al., 2009; Vajta et al., 1997). مزیت این روش میزان سرد و گرم کردن سریع بیشتر از ۲۰۰۰۰°C/min، تماس کوتاه مدت با غلظت های بالای مواد محافظ انجمادی، جلوگیری از آسیب های سرمایی، کاهش اثرات توکسیک و شوک اسمزی می باشد (Gajda et al., 2009). ولی مشکل این روش این است که شناور کردن نی در نیتروژن مایع نیاز به درپوش دارد و از طرفی امکان شکستن غشای شفاف وجود دارد که در جنین ها و تخمک های منجمد-ذوب شده یک پدیده شایع است و همزمان با سرد یا گرم شدن با سرعت بالا اتفاق می افتد (Kasai et al., 1996). با بهره گرفتن از این روش از سال ۱۹۹۷ تا کنون گزارش های موفقی از انجماد شیشه ای تخمک ها و جنین ها درگونه های مختلف جانوری مانند خوک[۶۵] ،گاو[۶۶] ،اسب[۶۷] و…. گزارش شده است (Gajda et al., 2009).
۱-۸-۴-۲- روش EMG (Electron Microscope Grid) یاnylon mesh
از EM grid به منظور انجماد شیشه ای تخمک ها، بلاستوسیست های گاوی، زیگوت های انسانی و تخمک ها و جنین های دیگر پستانداران نیز استفاده می شود. در این روش نیز تماس مستقیمی بین تخمک ها و جنین ها و نیتروژن مایع وجود دارد که باعث افزایش میزان سرما می شود. میزان سوسپانسیون تخمک ها وجنین ها همراه با مواد محافظ انجمادی در این روش کمتر از۱-۲µlمی باشد Gajda et al., 2009) (که انتقال سریع دما و تعادل کوتاه مدت در این روش، به جلوگیری از آسیب اسموتیک ناشی از غلظت بالای مواد محافظ انجمادی کمک می کند و در نتیجه میزان بقاء پس از ذوب را افزایش می دهد. مزیت دیگر این روش این است که سریع بوده و در مقایسه با انجماد آهسته نیاز به امکانات کمتری دارد. عیب این روش، آسیب مکانیکی است که ممکن است به جنین ها در اثر چسبیدن به گرید وارد شود که به علت نیاز به سلامت مورفولوژیک تخمک ها و جنین ها پس از انجماد قابل چشم پوشی نیست (Chung et al., 2000).
۱-۸-۴-۳- روش SSV (Solid Surface Vitrification)
در این روش از یک مکعب فولادی پوشیده شده توسط فویل آلومینیومی استفاده می شود که در نیتروژن مایع قرار داده شده و تا دمای -۱۸۰°C سرد می شود. در این روش قرار دادن تخمک ها و جنین ها بر روی مکعب فولادی دشوار بوده و امکان از دست دادن آنها وجود دارد (Gajda et al., 2009; Nedambal et al., 2006). با این حال مطالعات، میزان بقا و رشد و تکامل بالایی را پس از انجماد شیشه ای تخمک ها و جنین های گاوی و بزی[۶۸]به روش SSV گزارش می کنند. اخیرا نیزSSV جهت انجماد شیشه ای تخمک های بالغ[۶۹] و جنین های خوک و گوسفند[۷۰] استفاده شده است (Gajda et al., 2009).
۱-۸-۴-۴- روش cryoloop
روش کرایولوپ، عبارتست از حفظ انجمادی تخمک ها و جنین ها با بهره گرفتن از یک حلقه ی نایلونی باریک که به یک دسته پلاستیکی محکم متصل شده است که برای محافظت از این نوار باریک در LN2، از یک درپوش برای پوشاندن آن استفاده می شود (Gajda et al., 2009). این روش برای اولین بار به منظور انجماد محلولهای پروتئینی و سپس حفظ انجمادی بلاستوسیست های انسانی، میمون و همچنین تخمک ها به کار برده شده است
(Gajda et al., 2009; Lucena et al., 2006). حجم کم مواد محافظ انجمادی همراه با نمونه بر روی کرایولوپ و نیز تماس مستقیم با LN2 منجر به افزایش بسیار زیاد سرما می شود. هم چنین از مزایای دیگر این روش این است که به لحاظ داشتن در پوش امکان آلودگی جنین ها و تخمک ها کاهش می یابد (Lucena et al., 2006). با این وجود cryoloop وسیله ای حساس و انعطاف پذیر می باشد که باعث خطر از دست دادن تخمک ها یا جنین ها در زمان قرار گرفتن آنها بر روی کرایولوپ یا در زمان ذوب کردن می شود (Gajda et al., 2009).
۱-۸-۴-۵- روش cryotop (minimum-volume cooling)
این روش از دیگر روش های انجماد شیشه ای است که با کمترین حجم (<0/1ml) ماده محافظ انجمادی انجام می شود (Kuwayama et al., 2006; Karlsson et al., 1996). کرایوتاپ یک نوار باریک با عرض ۱/۰ میلی متر که با یک دسته پلاستیکی محکم متصل شده است، به لحاظ محافظت از این نوار باریک در LN2، از یک درپوش برای پوشاندن آن استفاده می شود. در این روش علاوه بر حجم ماده محافظ انجمادی کمی که به همراه جنین یا تخمک بر روی کرایوتاپ قرار می گیرد سرعت سرما نیز در اثر تماس مستقیم تخمک یا جنین با ازت مایع (-۱۹۶°C) افزایش می یابد (Kuwayama et al., 2006). این روش باعث می شود که تخمک ها و جنین ها از یک منطقه دمایی+۲۰°C تا -۲۰°C عبور کنند و از آسیب های سرمایی که به ساختار آنها وارد می شود، بکاهد (Gajda et al., 2009). روش cryotop ساده، سریع و به سهولت قابل یادگیری می باشد و جهت انجماد تخمک ها و جنین های انسانی در تمام فازهای رشد مورد استفاده قرار می گیرد
(Karlsson et al., 1996). اولین تولد زنده حاصل از جنین های منجمد-ذوب شده به روش کرایوتاپ در آمریکا گزارش شده است (Karlsson et al., 1996;Katayama et al., 2003). هم چنین این روش به طور موفقیت آمیز جهت انجماد شیشه ای تخمک های نابالغ[۷۱] و بالغ اسب (Bogliolo et al., 2006)، گاو، گوسفند، جنین های خرگوش[۷۲] و خوک بکار گرفته شده است (Kuwayama et al., 2006; Gajda et al., 2009; Morato et al., 2008).
۱-۸-۵- محلولهای انجماد شیشه ای
محلولهای انجماد شیشه ای دارای چند جزء مشترک هستند:
هر محلول دارای غلظت بالایی از ضد یخ است که می تواند به داخل سیتوپلاسم جنین نفوذ کند. محلولهای انجماد شیشه ای اولیه که به نام VS1 وVS1 90% خوانده می شدند مخلوطی از ضد یخهای نفوذ کننده و غیر قابل نفوذ بودند(Baxtor & Lathe, 1971; Fahy, 1984).
هر محلول محتوی یک محلول فیزیولوژیکی سالین است که ایزوتونیته نهایی را باعث شده، در ضمن سطح طبیعی محلول خارج سلولی را حفظ کرده و از بهم خوردن بالانس اسمزی جلوگیری می کند (Meryman, 1982).
با اضافه نمودن ماکروملکولهایی همچون پلی اتیلن گلایکول[۷۳] توانایی محلول برای بسیار سرد شدن و شیشه ای شدن افزایش پیدا می کند (Leibo & Loskutoff, 1993).
۱-۸-۶- جنبه های اساسی انجماد شیشه ای
در انجماد شیشه ای بافت و سلولهای بیولوژیک بایستی روشهایی را بکار برد که از تشکیل بلورهای یخ در درجه حرارت پایین جلوگیری شود. به این منظور و با هدف کاهش آسیب وارده به نمونه ها موارد زیر پیشنهاد می شود:
- از حجم نمونه کاسته شود و به تعداد بیشتر تقسیم شود (Rasmussen & Luyet, 1969).
- با سرد کردن سریع دیگر زمان کافی برای تشکیل بلورهای یخ در محلولهای شفاف فراهم می شود. محاسبات نشان داده که اگر آب خالص با سرعت ۱۰۰ میلیون درجه در ثانیه سرد شود ، شیشه ای می شود (Uhlmann, 1972).
- استفاده از ضد یخ در کاهش تشکیل بلور یخ موثر می باشد و اثر سودمند افزودن محلول ضد یخ آن است که درجه حرارت تعادلی انجماد را کاسته، از میزان تشکیل هسته های بلور یخ نیز کم می کند در حالی که ویسکوزیته محلول را در درجه حرارت زیر صفر افزایش می دهد (Leibo & Loskutoff, 1993).
- برخی از محققین پیشنهاد کرده اند که اگر به محلول در طی پروسه انجماد فشار هیدرواستاتیک بالایی اعمال شود اثرات مشابه افزودن ضد یخ دیده می شود (Kasai, 1994) این فشار قادر است از تشکیل هسته های بلور یخ جلوگیری کند
(MacFarlane et al., 1981).
۱-۸-۷- زمان تعادل و آبگیری جنینها
مدت زمانی که جنین به منظور آبگیری و دهیدراسیون در محلول حاوی ضد یخ قرار گرفته و ضد یخ به درون سلول نفوذ می کند اصطلاحا زمان تعادل نامیده می شود. مدت زمان تعادل وابسته به نوع ضد یخ مورد استفاده شده می باشد بطوری که هر چقدر میزان نفوذپذیری ضد یخ بیشتر باشد زمان تعادل کمتر خواهد بود. درجه حرارت و مدت زمان قرار گیری جنینها در محلول انجمادی نیز بر میزان سمیت ضد یخ موثر است دوره طولانی تعادل باعث می شود که غلظت بسیار بالای ضد یخ جنین را نسبت به شوک اسمزی حاصل از جریان سریع آب به داخل سلول حساس تر نماید. در این زمینه آزمایشات زیادی انجام شده است. برای تعیین بهترین زمان تعادل قبل از انجماد جنین های ۸ سلولی موش در حرارت ۵ درجه سانتی گراد به مدت زمان های مختلف در یک محلول انجماد شیشه ای حاوی اتیلن گلیکول، فایکول و ترهالوز قرار داده شده و بعد از ذوب در آب ۲۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت در محیط ۵-برومو۲-دیاکسی یوریدین کشت داده شدند در این آزمایش تکامل جنینی و تعداد کروماتیدهای خواهری معاوضه شده که شاخص حساس برای تعیین آسیب ژنتیکی می باشد مشاهده شد. این مطالعه نشان داد که بهترین زمان تعادل در محلول انجماد شیشه ای ۵ دقیقه می باشد (Rall, 1987).
۱-۸-۸- آب دهی نمونه ها و خروج محلول ضد یخ از آنها
