روش تهیه : محیط کشت به صورت صنعتی ساخته می شود و طبق دستور العمل کارخانه توسط آب مقطر آماده شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که در دمای ۲۵ درجه سلسیوس برابر ۷ باشد. محیط را در ارلن‌هایی با گنجایش مناسب توزیع نموده و سپس در اتوکلاو به دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت زمان ۲۰ دقیقه سترون گردید.
Selenit enrichment :
روش تهیه: محیط کشت به صورت صنعتی ساخته شده و طبق دستورالعمل کارخانه توط آب مقطر آماده شد. این محیط نیازی به سترون شدن توسط اتوکلاو نداشت. محیط آماده در لوله‌های آزمایش به انداه ۱۰cc تقسیم میشد.
سالمونلا – شیگلا:
محیط کشت به صورت صنعتی ساخته شده و طبق دستور العمل کارخانه توسط آب مقطر ساخته شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که در دمای ۲۵ درجه سلسیوس برابر ۷ باشد. محیط در پلیت‌های شیشه‌ای یا یکبار مصرف تقسیم میشد.
محیط آهن‌دار سه قندی (TSI):
روش تهیه:
محیط کامل را که به صورت صنعتی ساخته شده طبق دستورالعمل کارخانه در آب مقطر حل شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد تا برابر ۴/۷ باشد. محیط به حجم‌های ۱۰ml در لولههایی با گنجایش مناسب توزیع شد سپس در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس در لولههایی با گنجایش مناسب توزیع گردید و آنگاه در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت زمان ۱۰ دقیقه سترون شد. لوله‌ها در شیب مناسب قرار داده شد تا پس از انعقاد دارای ۲cm عمق و سطح مناسب باشد.
محیط اوره آگار:
روش تهیه:
محیط کامل را که به صورت صنعتی ساخته شده طبق دستور العمل کارخانه در آب مقطر حل نموده. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که برابر ۸/۶ باشد. محیط در اتوکلاو به دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت زمان ۲۰ دقیقه سترون شد. سپس به آن محلول اوره را که به صورت آماده وجود داشت توسط فیلتر با کتریولوژی به آن اضافه گردید. برای هر ۱۰۰۰cc از محلول پایه ۵۰cc محلوله اوره به آن اضافه می‌کنیم.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
طرز تهیه محلول اوره:
۴۰gr اوره در ۱۰۰ml آب مقطر حل شد. این کار با بهره گرفتن از فیلتر باکتریولوژی انجام گردید. محیط کامل در شرایط سترون به حجم‌های ۱۰ml در لولههایی با گنجایش مناسب توزیع شد لوله‌ها در شیب مناسب قرار داده شد تا منعقد گردد.
محیط L – لیزین دکربوکسیلاسیون:
روش تهیه:
محیط طبق دستورالعمل کارخانه سازنده توسط آب مقطر ساخته شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که برابر ۸/۶ باشد. محیط را به حجم‌های ۵ml در لولههایی با گنجایش مناسب توزیع نموده. سپس در اتوکلاو به دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت زمان ۱۰ دقیقه سترون گردید.
محلول کواکس به صورت آماده خریداری شد.
محیط مغذی نوترینت آگار:
طرز تهیه: محیط کشت کامل طبق دستورالعمل کارخانه سازنده توسط آب مقطرساخته شد وpH آن به گونه‌ای تنظیم گردید که پس از سترون کردن محیط برابر ۷ باشد. سپس آن را در لوله‌های استریل تقسیم کرده و در اتوکلاو به مدت زمان ۲۰ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس سترون شد.
شمارش اشرشیاکلی در گوشت سفید وقرمز:
یک سری سه لوله‌ای از هر دقت آماده شد. به هر یک از سه لوله محیط کشت غنی کننده انتخابی لوریل سولفات با غلظت مضاعف با بهره گرفتن از یک پیپت سترون ۱۰ml از سوسپانسیون اولیه انتقال داده شد این مقدار از نمونه برابر با یک گرم نمونه در هر لوله می‌باشد.
سپس به سه لوله محیط کشت غنی کننده انتخابی با غلظت معمولی با بهره گرفتن از پیپت سترون دیگری، ۱ میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه تلقیح شد. این مقدار از نمونه برابر با ۰٫۱gr نمونه در هر لوله می‌باشد.
با بهره گرفتن از دقت ۱/۰ به دست آمده رقت های بعدی مانند ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ تهیه گردید. برای هر رقت از پپیت سترون جدید استفاده شد و به دقت لوله های تشت تلقیح شده مخلوط گردید.
لوله های محیط کشت با غلظت مضاعف و لوله‌های محیط کشت با غلظت معمولی در دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت زمان ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری شد. اگر در این مرحله گاز یا کدورت در لوله هامشاهده نمیشد گرمخانه گذاری ۲۴ ساعت دیگر ادامه مییافت.
اگر بعد از ۴۸ ساعت دوره گرمخانه گذاری کدورت بدون گاز ایجاد میشد ازآن به محیط EC تلقیح می شود.
تلقیح و گرمخانه گذاری آب پپتونه:
با بهره گرفتن از حلقه کشت از هر لوله گرمخانه گذاری شده که در آن گاز مشاهده میشد به لوله حاوی آب پپتونه که دمای آن به ۴۴ درجه سلسیوس رسیده بود تلقیح گردید و به مدت زمان ۴۸ ساعت در دمای ۴۴ درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد.
کشت و گرمخانه گذاری محیط کشت انتخابی (EC) :
از هر لوله محیط کشت با غلظت مضاعف که در آن کدورت یا گاز مشاهده میشد و از هر لوله محیط کشت با غلظت معمولی که فقط گاز در آن مشاهده میشد، به وسیله حلقه کشت به لوله حاوی محیط کشت EC تلقیح گردید.لوله‌های تلقیح شده را درحمام آب گرم و یا گرمخانه در ۴۴ درجه سلسیوس به مدت ۲۴ساعت قرار داده. چناچه در این مرحله هیچ گازی در محیط کشت EC ایجاد نمیشد.گرمخانه گذاری تا مدت ۴۸ ساعت دیگر ادامه مییافت.
کشت و گرمخانه گذاری محیط کشت انتخابی (EC) :
از هر لوله محیط کشت با غلظت مضاعف که در آن کدورت یا گاز مشاهده می شد و از هر لوله محیط کشت با غلظت معمولی که فقط گاز در آن مشاهده میشد، به وسیله حلقه کشت به لوله حاوی محیط کشت EC تلقیح میگردید. لوله‌های تلقیح شده درحمام آب گرم و یا گرمخانه در ۴۴ درجه سلسیوس به مدت ۲۴ساعت قرار گرفت. چناچه در این مرحله هیچ گازی در محیط کشت EC ایجاد نشد. گرمخانه گذاری را تا مدت ۴۸ ساعت ادامه مییافت.
تلقیح و گرمخانه گذاری آب پپتونه:
با بهره گرفتن از حلقه کشت از هر لوله گرمخانه گذاری شده که در آن گاز مشاهده شود به لوله حاوی آب پپتونه که دمای آن به ۴۴ درجه سلسیوس رسیده بود تلقیح شد و به مدت زمان ۴۸ ساعت در دمای ۴۴ درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد.
بررسی تولید اندول:
۰٫۵ml از مصرف اندول به لوله های آب پپتونه که گرمخانه گذاری شده افزوده سپس خوب هم زده و پس از ۱ دقیقه مشاهده شد. مشاهده رنگ قرمز در فاز الکلی دلیل بر وجود اندول می‌باشد.
تفسیر نتایج:
چنانچه در هر یک از لوله های تلقیح و گرمخانه گذاری شده گاز مشاهده شد در لوله های آب پپتونه اندول تولید شده. از نظر وجود اشرشیاکلی مبثت در نظر گرفته می‌شود. برای هر رقت، تعداد لوله های مثبت با غلظت مضاعف و غلظت معمولی را شمارش کرده. وجود یا عدم احتمالی اشریشا کلی در نمونه مورد آزمون براساس وزن در گرم یا حجم در میلی لیتر از نمونه مورد آزمون گزارش گردیده.
روش شمارش: روش ۹ لوله ایی از هر سه لوله رقت‌های متفاوت هر کدام که طبق نشانه های گفته شده در بخش قبل مثبت فرض شد را برداشته ومطابق اعداد جدول آن خوانده شد. اما طبق مصوبه دامپزشکی در سال ۱۳۸۶ فقط سه لوله با غلظت های معمولی برای سه رقت ۱/۰،۰۱/۰، ۰۰۱/۰به کار می‌رود و نتایج به صورت ۵۰، بیشتر از ۵۰، کمتر از ۵۰ و ۱۰۰ در هر گرم بیان شده.
محیط آب پپتونه بدون اندول:
روش تهیه:
محیط کشت صنعتی آماده طبق دستورالعمل آن ساخته و pH محیط به گونه ایی تنظیم شد تا پس از سترون شدن در ۲۵ درجه سلسیوس ۳/۷ باشد. سپس آن را در مقادیر ۵ml تا ۱۰ml در لوله های آزمایش تقسیم کرده و در اتوکلاو ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۱۵ دقیقه سترون شد.
اندول (کواکس) : به صورت تجاری آماده به مصرف بود.
لوریل سولفات (محیط غنی کننده انتخابی):
روش تهیه:
این محیط کشت به صورت تجاری تهیه و فقط طبق دستورالعمل کارخانه ساخته میشد. ماده فوق در آب مقطر حل شده و pH محیط به گونه‌ای تنظیم شد که بعد از سترون شدن در ۲۵ درجه سلسیوس ۸/۶ باشد.
سپس محیط کشت طبق دستور العمل در غلظت‌های معمولی و مضاعف ساخته شد و در حجم های ۱۰ml در لوله‌های آزمایش تقسیم شد. این لوله‌های آزمایش باید دارای لوله‌های دورهام باشد. سپس در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۱۵ دقیقه سترون شدند. پس از سترون شدن لوله‌های دورهام بایستی بدون حباب هوا باشند.
EC (محیط انتخابی)
روش تهیه:
این محیط کشت به صورت تجاری تهیه شده و فقط طبق دستورالعمل کارخانه ساخته شد. ماده فوق در آب مقطر حل شده و pH محیط به گونه‌ای تنظیم شد که بعد از سترون شدن در ۲۵ درجه سلسیوس ۸/۶ باشد. سپس محیط در حجم‌های ۱۰ میلی‌لیتر در لوله‌های آزمایش حاوی لوله دورهام تقسیم شد و در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۱۵دقیقه سترون گردید. پس از سترون شدن لوله‌های دورهام بایستی بدون حباب هوا باشد، سپس تلقیح انجام شد. لوله های تلقیح شده در حمام آب گرم و یا گرمخانه در ۴۴ درجه سلسیوس به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت. چنانچه در این مرحله هیچ گازی در محیط کشت EC ایجاد نمیشد، گرمخانه گذاری تا مدت ۴۸ ساعت ادامه داده شد.
نتایج به دست آمده و بحث
نتایج
نتایج به دست آمده با روش کروماتوگرافی مایع
شکل ۴‑۱: کروماتوگرام تزریق مسققیم محلول‌های مادر پنی‌سیلین
