جدول شماره ۳-۱ - مواد لازم در مخلوط واکنش ترانویسی معکوس (RT)
| مقدار مواد | نوع ماده |
| ۲ | dNTPs (10 mM) |
| ۲ | DTT (Dithiotreitol) (100 mM) |
| ۱۰ | Mmulv RT buffer (5x) |
| ۳ | Reverse Primer (N1T) 10µM |
| ۳۲ | Deionized water |
cDNA ساخته شده بطریق فوق یا بلافاصله بکار برده شد و یا برای مصارف بعدی در ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری گردید
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۳-۹- انجام واکنش PCR
۳-۹-۱- طراحی پرایمر
پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق بر اساس آنالیز هم ردیف سازی توالی مربوط به ۶۵ ایزوله و سویه از ویروس Y سیب زمینی (که از بانک جهانی ژن NCBI دانلود شده بود) طوری طراحی گردید که بتوانند تمام ایزولههای احتمالی را تکثیر کنند که توالی این پرایمرها به شرح زیر می باشد :
جدول ۳-۲- توالی و موقعیت آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق
| موقعیت آغازگر دمای اتصال قطبیت توالی نام آغازگر روی ژنوم |
| F1 CAA CTC CAG ATG GAA CAA TTG مستقیم ۵۸ ۷۸۸۲-۷۸۶۱ F2 GCC AAC TGT GAT GAA TG 8875-8858 57 مستقیم R1 CCA TTC ATC ACA GTT GGC 8875-8858 57 معکوس R2 GTAGAG TAT GCA TAC TTG GAG9318-9298 56 معکوس |
پس از انجام واکنش RT و ساخت cDNA، جهت تکثیر cDNAی تولید شده، واکنش PCR انجام شد. در زمان اجرای آزمایشها برای جلوگیری از بروز خطای زمان، برداشتن مقادیر بسیارکم مواد و نیز برای راحتی و سرعت عمل بیشتر، محلول پایه واکنشهای PCR طبق جدول ۳-۴ تهیه شد. محلول پایه شامل همه مواد مورد نیاز برای واکنش به جز cDNA و آغازگرهای اختصاصی هر نژاد بود.
۳-۹-۲ روش آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
برای انجام واکنش PCR از ترکیبات لازم طبق جدول شماره ۳-۲ و آغازگرهای جدول شماره ۳-۴ استفاده شد. آغازگرهای اختصاصی برای MDMV با بهره گرفتن از نرم افزار Fast PCR طراحی شدند (شکل ۳-۲). برنامه PCR متشکل از یک چرخهی ۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۴ دقیقه به منظور واسرشته سازی اولیه و ۳۵ چرخه شامل واسرشته سازی در ۹۴ درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه ، اتصال به مدت یک دقیقه در دمای مناسب برای هر جفت آغازگر (جدول شماره ۳-۴) و سنتز در ۷۲ درجه به مدت یک دقیقه و به علاوه یک چرخه در دمای ۷۲ درجه به مدت ۱۵ دقیقه برای امتداد رشتهها بود (جدول شماره ۳-۳). PCR در دستگاه Thermocycler شرکت اپندورف و یا مدل iCycler شرکت Biorad انجام شد.
جدول شماره ۳-۳- مواد لازم در واکنش PCR
